作者：姚开泰 转自：第四届全国肿瘤综合诊疗新进展研讨会 癌的基因治疗是基因治疗的一个分支,用免疫学方法研究癌的靶向基因治疗也是癌基因治疗的一个重要方面,但不在本文讨论的范围之内.
据美国国立卫生研究院2000年的定义:基因治疗指采用实验医学干扰手段改变活细胞的遗传物质而与疾病作斗争. 用基因治疗作治疗手段的疾病主要有人类严重免疫缺陷病,HIV和癌症。
癌靶向基因治疗的载体
运送插入基因的载体可分为病毒载体和非病毒载体,常用的病毒载体有逆病毒、腺病毒、腺相关病毒等.非病毒载体则有脂质体、脂质体/DNA复合体(lipoplex)、裸DNA等.
用作基因治疗的病毒型载体可分为两型.
(一) 复制缺陷型病毒 此时病毒作为载体,运送药物前体 、自杀基因、瘤基因和抑瘤基因等.
(二) 复制型病毒 有病毒基因丢失型(onyx-015,HSV-1),增加治疗基因及启动子的修饰型(CV706,腺病毒,编码GM-CSF的重组牛痘病毒)以及野生型病毒(呼肠孤病毒、疱疹性口腔炎病毒).
onyx-015曾是一个引人注目的、靶向治疗肿瘤的重组腺病毒.原设计思路是p53基因突变是人类肿瘤中最常见的遗传学改变.腺病毒的E1B 55K可与宿主细胞中野生型p53结合并将其灭活.因此构建了将E1B除去的重组腺病毒.它不再灭活wt p53,只能在p53缺失的细胞中复制,从而可靶向p53突变的细胞,通常即为肿瘤细胞.但后来发现onyx-015也能在wt p53细胞中复制,复制效率要低很多,复制速度也慢.由于onyx-015毕竟还能杀死瘤细胞,故仍在进行临床试验.
腺病毒一类DNA病毒在细胞内复制,结果致细胞裂解死亡,故称溶瘤病毒, 一般不罹患正常细胞。溶瘤病毒的治疗指数很高,可达100,000:1,一般化疗的治疗指数为6:1,因此近年来备受关注.例如疱疹性口腔炎病毒.呼肠孤病毒在动物试验中已经证实对卵巢和结肠癌有效。
目前进入临床试验的溶瘤病毒有onyx-015,CV706,G207,V-GM-CSF,Reo,VSV.
靶向肿瘤相关基因
众所周知,近20年的研究已经明确与肿瘤发病相关的基因主要是两类,即瘤基因和抑瘤基因(近年来还增列了增变子mutator一类基因)。
瘤基因能引起动物和人的肿瘤,能将培养中的正常细胞转化成恶性细胞。由于点突变、基因扩增、或染色体重排致瘤蛋白增多,刺激细胞分裂生长.因此属于获得功能(gain in function).瘤基因来自细胞的原瘤基因,是正常细胞中原瘤基因的突变、活化型.原瘤基因蛋白刺激正常细胞有序的增殖,瘤蛋白是细胞信息的异常转导因子,刺激肿瘤细胞无序繁殖.
据Volgstein B认为人结肠癌的发病符合多阶段、多基因的线性模型.涉及多个瘤基因和抑瘤基因的参与.我们用比较基因组杂交(CGH)的资料构建肿瘤(鼻咽癌)发生的树模型,认为肿瘤发生和发展是多阶段、多基因和多途径的。
遗传性单基因病的治疗,如ADA,可以针对一个缺陷基因用一个野生型基因取代获得成功,肿瘤的治显然不能采用同样的策略.但最近根据转基因动物身上的研究,发现一种瘤基因依赖现象(oncogene addiction),就是说肿瘤的发生涉及多个瘤基因的作用,但有些瘤基因的作用依赖于某个瘤基因,即有主次之分,如把主基因打掉,就会导致瘤细胞分化或凋亡,这一发现对肿瘤的靶向瘤基因治疗指出了希望。
抑瘤基因则有所不同,众所周知,有的抑瘤基因是细胞周期的重要调控者(如RB基因),有的维持基因组的整体完整性(如BrCa1)。实验研究和临床实践中已经发现,将单个抑瘤基因的野生型转入瘤细胞后对恶性表型有明显的影响,被称为对抑瘤基因的超敏性(hypersensitivity to tumor suppressors)。因此用抑瘤基因的靶向治疗仍是不断探索的热点.
晚近一些高通量技术,如全基因组扫描、CGH、全基因组甲基化分析等在肿瘤研究中的应用,发现肿瘤基因组的改变很多,除了上述瘤基因的gain in function 以外,还有抑瘤基因的lost in function。后者可以是homozygous deletion(极少数)或haplo-insufficiency,还有抑瘤基因启动子区CpG岛的高甲基化是多个抑瘤基因表达下调的重要原因。它们与肿瘤发生发展有什么联系?实际上肿瘤细胞中信息传导通路已不同于正常细胞,一些肿瘤相关基因表达的上调或下调只是信息传递网络中的改变或调整,所起的作用已不同于在正常细胞中的作用。
靶向病因
肿瘤的病因主要是化学致癌物,但也有一部分与病毒有关.如肝癌、宫颈癌、鼻咽癌都是我国的常见癌,病因都涉及DNA瘤病毒.近年来报道的RNAi被称为基因组的免疫系统,具有很强的抗病毒作用. RNAi的作用最早在线虫中发现.将双链DNA注入线虫,用原位杂交检测mRNA(par-1),未注射及注射反义RNA均为阳性,只有阴性对照和注射dsRNA的无mRNA表达.RNAi现象有以下特点:
干扰因子为dsRNA,不是ssRNA。mRNA和蛋白质的不表达有序列特异性.对外显子而非内含子有效.作用很强,每个细胞只要几个分子就有效.作用且持久,可影响下一代.效果还可跨越细胞屏障(口服,浸泡).这一现象相继在细菌、低等动物和植物中证实,但在哺乳动物细胞中遇到了困难,长链dsRNA启动全局性基因沈默(非特异性,如干扰素反应).这一问题在2001年获得突破,发现短dsRNA(～22nt)能在哺乳动物细胞中诱导RNAi.
RNAi现象的机制十分复杂,是一种多个酶参与的反应。
RNAi的生物学作用主要在调节基因功能,同时作为基因组的＂免疫系统＂,抗病毒感染、抑制转位子活性、对异常RNA发生反应.应用方面主要也是作为检测基因功能的工具和抗病毒和基因治疗. 因此可作为癌的靶向基因治疗工具.2002年10月才取得惊人的进展.宫颈癌与人乳头瘤病毒咸染有关,乳头瘤病毒的E6和E7蛋白分别与p53和RB蛋白结合,将它们灭活是宫颈癌主要的发病机制.应用RNAi技术使E6和E7表达沈默就能使体外培养的宫颈癌细胞不增殖和凋亡.
分子分类与靶向基因治疗
肿瘤的分类对临床治疗至关重要,目前主要依据病理形态学分类,但病理组织学表现相同的肿瘤,临床病程及对治疗反应可明显不同.
肿瘤的分类可有两种情况,一是发现新的亚类.二是归入早已明确的类别.分子病理学的研究表明,根据基因表达谱.可将有些肿瘤进一步细分.Golub开创了肿瘤分子分类的先例,根据基因表达谱可明确区分AML和ALL,属于笫二种分类.接着Alizadeh 等对弥漫性大B细胞淋巴瘤的研究，基因表达谱分析表明LDBCL可进一步分为GC B-like和Activated B-like 两个亚型,属于笫一种分类.治疗后两者的五年生存率明显不同.因此肿瘤的分子分类引起了广泛的关注.先后己报道了前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌等等.鼻咽癌最常见为鳞癌三级,也即低分化鳞癌.据我们用基因表达谱初步研究,NPC的低分化鳞癌至少可分为两个亚型,它们的生物学及临床意义正在进一步研究中.
肿瘤干细胞
肿瘤起源于干细胞的看法早就存在,现在提出\’肿瘤干细胞\’的概念,指肿瘤中含有少数细胞具有无限的增殖潜能,驱动肿瘤的形成和生长.正常干细胞是引起细胞转化的突变的靶,而瘤干细胞则驱动肿瘤细胞增殖.干细胞最重要的特征就是自我更新(self-renewal),正常和瘤干细胞都具备这种能力,不同的是正常干细胞自我更新也即细胞分裂增殖和分化是受控制的,增殖和分化维持平衡,处于有序状态;而肿瘤干细胞的自我更新是失控的、无序的.
目前有关肿瘤干细胞存在的证据主要也是根据它的自我更新能力,实验验证有体外的集落形成试验和体内的脾集落检定.例如小鼠骨髓瘤中只有1%～0.01%的细胞能在软琼酯中形成集落,同样肺癌、卵巢癌或神经母细胞瘤在软琼酯中具集落形成能力的也只有0.1%～0.02%的比例.白血病细胞也只有1～4%的细胞在体内能形成脾集落.据此现在认为少数肿瘤细胞有持久的致瘤能力和形成肿瘤,它们就是肿瘤干细胞.其他瘤细胞只有有限的自我更新能力.肿瘤干细胞对于治疗肿瘤有重大意义.现在的治疗可使瘤体积缩小,主要杀死增殖能力有限的瘤细胞,瘤干细胞未杀死就成为复发的基础,如治疗时能特异性杀死瘤干细胞,即使瘤体积不缩小,待以时日,肿瘤也会消退.
因此靶向基因治疗或靶向治疗均应指向瘤干细胞.目前尚无好的实用的办法将瘤干细胞与一般瘤细胞或正常干细胞区分.这巳成为一个研究热点.有报道人AML干细胞是CD34＋CD38–细胞,约占AML细胞的0.2%,为此提供了线索.最近Michigan大学的科学家报道了分离到人乳腺癌干细胞是CD44＋CD24－细胞。
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