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笋有效成分熊果酸诱导HL-60细胞凋亡的实验研究

http://www.wd999.com 2006-1-19 14:25:47

黄镜孙燕陆士新苏涛焦顺昌内容提要目的：探讨芦笋有效成分熊果酸对HL-60细胞增殖、凋亡的影响。方法：用MTT法、DNA凝胶电泳、形态学方法等测定熊果酸对HL-60细胞增殖、调亡的影响。结果：熊果酸抑制HL-60细胞增殖，对HL-60细胞的半数生长的抑制剂量（IC50）为8.26µmol/L，并能诱导其发生凋亡。结论：熊果酸通过抑制HL-60细胞增殖和诱导其凋亡发挥抗肿瘤作用。关键词熊果酸 HL-60细胞凋亡芦笋有一定的抗肿瘤作用，为进一步探讨其作用机理，我们从中分离、提纯并鉴定了熊果酸。熊果酸属于三萜类化合物，具有抗突变、抗促癌及抗肿瘤增殖的作用，已引起了国内外学者的广泛注意。细胞凋亡是细胞死亡的两种方式之一，不同于细胞坏死。细胞凋亡具有特殊的生化和形态变化。迄今发现，许多肿瘤药物能够诱导肿瘤细胞产生凋亡，有些抗肿瘤药的抗肿瘤作用强度平行于它们诱导肿瘤细胞凋亡的活性。本研究以HL-60细胞为材料，研究熊果酸的细胞毒作用和对HL-60细胞凋亡的影响，探索熊果酸抗癌作用及其机理。材料和方法 1 材料 1．1 人急性早幼粒白血病细胞株（HL-60）由美国Mount Sinai医学院Scanlon K.博士赠送，在中国医学科学院药物所传代培养，接种于含10%小牛血清（天津产，经56℃，30min灭活）、双抗的RPMI-1640（GIBCO）培养液，在37℃，5%CO2的培养箱内传代。 1．2 药品熊果酸由天津市医药科学研究所植物化学室提供，纯度>99.9%，不溶于水，二甲基亚砜浓度不超过0.1%。RNA酶（RNaseA,Sigma公司产品）和蛋白酶K（Proteinase K, Merk公司产品）：均按分子克隆实验指南配成10mg/ml，分装后置-20℃备用。Nonider P-40(NP-40):Fluka公司产品。溴化噻唑蓝四唑（MTT）：ICN公司产品。琼脂糖、台盼蓝：均为Sigma公司产品。 2 方法 2．1 熊果酸的细胞毒作用按MTT法测定，见文献。实验中设加熊果酸组和等浓度溶剂（二甲基亚砜）对照组，分别与HL-60细胞培养4天后检测。 2．2 细胞DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳，分别以5、10、20、30、50、µmol/L，熊果酸处理HL-60细胞25h，参照文献收集3×103细胞，用含2mmol/L EDTA的PBS洗两次，加0.1mlTBE缓冲液（Tris.HCI45mmol/L pHS.0.含1mmol/L EDTA）。0.25%NP-40及RnaseA（终浓度为1%），混匀后，37℃保温30min；再加入Proteinase K（终浓度为1mg，L.37℃继续保温30min，取上清液30µl，加5µl上样缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶上电泳（4V/cm），紫外光下观察并摄影。 2．3 细胞形态观察收集适量细胞涂片、晾干后，以Wright-Giemsn染色10min olynpus BH2型显微镜油镜结果 1 熊果酸的细胞毒作用与对照组比较，熊果酸对HL-60细胞生长的抑制很明显，其作用与浓度呈依赖性，经直线回归法算出IC50=（8.26±0.57）µmol/L(n=3)。 2 熊果酸诱导HL-60细胞凋亡（以DNA Ladder为标志）。用10-50µmol/L熊果酸处理HL-60细胞25h，细胞DNA在琼脂糖凝胶上显示清晰的DNA梯带（DNA Ladder）,DD IH SH IV GF 180-200bp的整倍数，提示熊果酸能够诱导HL-60细胞产生凋亡。同时随着药物浓度的增加，DNA条带的亮度增加，说明熊果酸的这一作用具有浓度依赖性。 3 细胞形态检测未经药物处理的HL-60细胞呈圆形，细胞核呈圆形或椭圆形，且大，胞浆少，内含嗜天青颗粒，约97%的细胞呈早幼粒形态。经10-50µmol/L熊果酸处理24h后，细胞出现一系列变化，核染色体发生聚集、断裂，部分细胞核膜崩解后，断裂的染色体形成粗细不匀的颗粒弥散于胞浆，部分细胞可见胞浆空泡及固缩。讨论熊果酸广泛存在于抗炎植物中，近年来研究表明，熊果酸可能对抗致癌物如B（α）P、黄曲霉素B1诱发的基因突变，抗促癌作用。另外，Lee等报道熊果酸对P-388和L-1210白血病细胞，A-549人肺腺癌细胞等多种肿瘤细胞有细胞毒作用，IC50<4µg/ml。因此，熊果酸的抗癌作用引起了人们的重视。本实验可以看到，熊果酸对HL-60细胞生长的抑制明显，其IC50<10µmol/L，说明熊果酸具有抗肿瘤增殖作用。近年来人们认为，肿瘤是细胞增殖和死亡失衡所致。细胞凋亡不同于细胞坏死。细胞的凋亡与肿瘤的发生、发展和消退有密切关系，具有独特的生化和形态特征。生物化学上凋亡最主要的变化是一种内源性Ca2+、Mg2+依赖性核酸内切酶被激活，使染色体DNA双链降解、断裂，DNA断裂的部分恰发生在核小体之间（inter-nucleosomal），形成寡聚核小体，在DNA琼脂凝胶电泳上显示核小体（180~200bp）大小的DNA梯带（DNA Ladder）。目前认为这是判断细胞发生凋亡的主要标准。形态上表现为细胞核染色体发生断裂、聚集，进而固缩、核膜崩解；细胞浆空泡变，最后胞膜凸出，形成凋亡小体（apoptotic vehicles）。凋亡的这些形态变化是一个连续的，不同步过程。本项实验以熊果酸诱导HL-60细胞发生的生化和形态特征均同文献报道的细胞凋亡的特征性变化一致，说明熊果酸诱导HL-60细胞凋亡。某些化疗药物，X-谢线均可引起肿瘤细胞的凋亡，熊果酸能抑制致癌物与促癌物的致癌作用，在本实验中熊果酸引起HL-60细胞的凋亡，它的作用与抗癌药物相似，表明熊果酸有抗瘤作用，其作用机理是抗增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。 ——《中国中西医结合杂志》1999，19（5）296-298 芦笋胶囊由中国癌症信息库--全国独家应用销售

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