胃癌差异表达基因的研究进展

    胃癌在我国恶性肿瘤中占据首要位置，在世界范围内也排在第二。胃癌病因复杂，与年龄、性别、社会经济状况、卫生水平及人口居住密度、烟酒嗜好、环境危险因素等有关。胃溃疡、胃息肉、慢性萎缩性胃炎、残胃为其癌前病变。近数年对HP的研究表明， HP感染不仅是肠型胃癌的危险因素，而且与弥漫型胃癌发生有关。尽管胃癌病因复杂，但是这些因素都在不同阶段作用于不同基因，引起相关基因的结构及表达水平改变，这些基因共同作用，导致胃癌的发生发展。
    现代分子生物学研究表明，人类基因组约由10万左右的不同基因组成，这些基因的选择性表达决定了机体整个生命过程，基因表达的变化处于控制生物学调节机制的中心位置。因此，研究胃癌不同发展阶段的基因表达变化，不仅有助于阐明胃癌的发病机理，而且还能为进一步开展胃癌的基因诊断和基因治疗提供重要的理论依据。
一、在胃癌组织中呈异常表达的癌基因
    十多年来的研究表明，胃癌的发生涉及到MAGE-1、2、3，ras、c-myc、met、k-sam、HER2/neu、c-erb-2、midkine等多种癌基因，而且在不同阶段具有不同的基因表达改变，这些癌基因表达改变影响着胃癌的生物学和临床行为。
1、ras基因
    人的ras基因家族包括同源的Ha- ras、Ki- ras和N- ras，它们分别定位于不同的染色体上，但均编码分子量约21KD的P21 ras蛋白。该蛋白位于细胞膜内侧，可结合GDP或GTP，与前者结合为非活性形式，与后者结合为活性形式，通过两种形式的转换来调节细胞的生理功能。P21 ras蛋白具有内源性GTP酶活性，与细胞的信号传递、增殖和分化有关。胃癌中活化的ras基因主要是Ha- ras和Ki- ras，而且活化频比例变化很大，在0-35%之间。在日本某地胃癌高发区，Ki -ras活化比例达20-50%；欧洲以Ki- ras基因活化为主，活化比例为21%，而南非、美国则只有9%左右；国内以Ha- ras活化为主，活化比例高达43.1%。朱月林等研究认为，ras基因表达预示胃癌细胞的增生和浸润能力增强，是胃癌恶性程度增高的表现。但是，也有人研究表明，胃癌中的ras基因表达在肠型胃癌中多于弥漫型胃癌，晚期多于早期，但ras基因的表达似乎并无肿瘤特异性，在发育不良、肠化生及消化性溃疡邻近的再生上皮，甚至在肿瘤附近的正常粘膜中同样呈高表达。
    总之，从现有资料看，ras基因并不是一个在胃癌中特异性很好的高表达基因。
2、C-erbB-2基因
    C-erbB-2基因定位于17q21，编码185KD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，参与信号转导。1989年ParK首次用杂交方法分析了50例胃癌组织，结果只有3例C-erbB-2呈过表达。因此认为C-erbB-2基因表达异常与人胃癌发生有关。进一步研究表明，C-erbB-2基因表达与肠型胃癌发生关系密切，而且是胃癌进展期的晚期事件。临床资料表明，C-erbB-2阳性胃癌转移性和侵袭性均较强，易侵及浆膜层，并易于出现淋巴结转移和腹膜种植。但近2年的研究表明，C-erbB-2表达与胃癌进展状态无关。国内学者研究认为，C-erbB-2在胃癌中有较高的表达比例（27.5%），C-erbB-2表达出现于胃粘膜癌变过程的后期，是胃粘膜细胞恶性变的标志，检测有无C-erbB-2高表达，对于胃癌的预判断具有重要意义。
3、C-met基因
    C-met基因定位于染色体7q21-31，编码190KD跨膜糖蛋白，具有酪氨酸磷酸化蛋白激酶活性。C-met在不易分化的人胃癌细胞株GTL-16和自然转化的小鼠NIH3T3成纤维细胞中呈过度表达，无基因重排。由于选择性剪接位点不同，从上皮细胞可表达多种C-met转录本，翻译成不同的met变异体。Rong等研究认为，met受体在肿瘤细胞中的高表达可能会赋予肿瘤细胞的一种生长优势。1991年Necla等研究认为，met基因高表达出现于胃癌形成早期，并反映了胃上皮细胞从浅表性胃炎到癌的发展中不断恶性化的遗传改变过程，但C-met基因在胃癌形成发展过程中的具体机理仍不清楚，仍有待于进一步研究。总之，检测有无C-met高表达，对胃癌的诊断具有一定意义。
4、C-myc基因
    C-myc基因定位于8q24，由3个外显子和2个内含子组成，第1个外显子不编码，只起调节作用。C-myc基因既是一种可易位基因，又是一种受多种物质调节的基因，具有促进细胞分裂并获永生化功能；C-myc基因编码62KD的核蛋白，有直接调节其它基因转录的作用，与细胞周期调控有关。1985年shibuya在部分胃癌细胞中发现C-myc基因扩增和高表达，且在快速生长和低分化腺癌中明显增高。Tatxuta则认为C-myc高表达有助于区分胃腺瘤和高分化腺癌。1991年Ninomiya检测213例胃癌，P62阳性比例为23.5%，漫润型多见，与淋巴管侵犯无关。P62表达者预后较差（P＜0.05），易出现复发尤其腹膜种植转移多见。Spandidos报告C-myc在胃癌中的表达比例为55%，表达高者浸润深度强，且表达与病程有关，进展型多见。总之，检测有无c-myc高表达，对胃癌的预后判断具有一定意义。
5、bcl-2基因
    bcl-2基因是一个重要的参与抗凋亡基因，它在残胃粘膜及胃癌中呈高表达，与病理类型无关，在胃癌发生中的具体机理仍不清楚，有待于进一步研究。
二、在胃癌组织中异常表达的抗癌基因
    在胃癌发病过程中，除了癌基因起作用外还涉及到另一类基因，即肿瘤抑制基因或抗癌基因,抗癌基因的失活是胃癌发生过程中的一个重要事件，研究抗癌基因在胃癌发生发展过程中的表达水平改变，对阐明胃癌的发生机理具有重要意义。
1、APC抑癌基因
    结直肠腺瘤性息肉基因（adenomatous polyposis coli gene ）即APC基因，定位于5q21，于1991年被Kinzler和Grodrn等首先分离出来，具有15个外显子和14个内含子，其开放读框含8535个核苷酸，编码含2843个氨基酸的蛋白，分子量约300KD。APC基因在胃癌发生中的作用不清楚，一般认为，与APC基因对应的染色体5q的缺失有关，仅见于分化好的病例，而不见于未分化型肿瘤。据报道，胃腺癌中，APC基因的LOH（杂合缺失）发生的可能为20-80%，且多见于胃癌早期，但Horri等检测胃癌病人发现3例（6.8%）APC基因突变，且均为组织未分化型（印戒细胞癌）而不见于未分化型肠型胃癌。总之，检测有无APC基因异常，对胃癌的早期诊断具有一定意义。
2、P53抑癌基因
    P53基因是一种16-20kb的DNA，定位于17P13.1，含11个外显子，编码含393个氨基酸残基的核磷蛋白，分子量约53KD，正常细胞中P53蛋白含量很低，但在人肿瘤及培养的转化细胞中可能高至正常的5-100倍，已证实野生型P53对细胞增殖的影响，包括作为细胞周期开关（cell-cycle checkpoint）调节细胞周期中G甛 S期的转化及通过凋亡来决定细胞的死亡。P53基因突变在胃癌的发生中起重要作用，它不仅可见于早期胃癌甚至在发育不良、肠化生及腺瘤中也可检测到。Brito等检测95例早期胃癌（T1期）邻近癌前期粘膜中P53表达，结果小管腺型胃癌阳性比例（46%）显著高于印戒细胞癌（10%），浸润至粘膜下层的胃癌（45%）高于无浸润者（30%），有淋巴结转移的8例T1期胃癌中5例为阳性（62%），肿瘤附近高度发育不良的粘膜标本中，有P53过表达者占15%，而肠化生及正常粘膜中未见阳性，提示P53的过表达与T1期胃腺癌的形态学指标有相关性，而且从粘膜高度发育不良甛早期胃癌甛晚期胃癌，P53阳性比例依次增高，支持胃癌的发展与P53异常有关。近研究表明，血中P53抗体增高是胃癌患者重要的不良予后指标。
3、DCC基因
    DCC基因定位于18q21.3, 约370kb,至少含8个外显子, 转录成10-12kb mRNA，编码750个氨基酸,分子量为190KD的磷酸化蛋白，其序列与神经细胞粘附分子及其它Ig超家族的细胞表面糖蛋白有明显同源性，具有4个Ig样区域及3个中间长丝结构域。DCC基因产物具有粘附因子样功能，其表达异常可能会引起细胞异常，导致细胞的恶性转化，肿瘤的浸润与转移。Iino等研究发现，该基因表达缺失或减低与胃癌的胃肠浸润深度、肝转移、临床分期相关。DCC基因mRNA表达缺失多出现在临床Ⅲ-Ⅳ 期及伴有淋巴结转移组，提示其表达改变在胃癌和转移中可能起重要作用。
4、P21基因
    P21基因即CIP1/WAF1基因，定位于6P21.2，全长约2.1kb，由3个外显子组成，分别由68 bp，450 bp和1600bp组成，转译起始信号位于第2号较长的外显子内，编码21KD的蛋白。在CIP1/WAF1基因上游分别约2.4kb和8kb处,各有一P53蛋白特殊结合位点, P53蛋白在其近氨基端有一转录活性很强的序列,可以刺激其结合位点下游基因的表达。P21在正常人的细胞中是以四价复合物的形式存在，它连接了细胞周期蛋白、CDK和PCNA，这是P21发挥其生物学功能的结构基础。在胃癌组织中P21蛋白表达阳性比例56.3%（18/32）明显低于癌旁胃粘膜组织96.6%（29/32）（P＜0.05），P21蛋白表达阳性比例与胃癌淋巴结转移呈负相关(P＜0.05），而在不同病理类型则未见明显差异（P＞0.05）。总之，P21的异常表达与胃癌发生、发展的关系有待于进一步研究。
5、P16基因
    P16基因定位于人类染色体9 P21，全长8.5kb，由2个内含子、3个外显子组成，外显子1为126bp，外显子2为307bp，外显子3为11bp，编码16KD蛋白，该蛋白包含一个148个氨基酸的开放阅读框架，并由4个圆钩状重复序列组成其空间构型，这一构型为维持P16活性所必需。P16除与CDK4有高度亲合性外，还能抑制与CDK4结构相似的另一个CDK6。其编码蛋白能特异性抑制CDK4和CDK2的活性，参与正常细胞周期的调控。P16基因在胃癌中存在纯合性缺失及5'端启动子区域的CpG岛高度甲基化，P16基因在胃癌中表达缺失比例高达41%，CpG高度甲基化可能使保留的等位基因不能转录。因此，检测P16基因表达改变对胃癌的诊断具有一定意义。
三、与胃癌相关的细胞周期基因
    近几年来，发现与胃癌密切相关的凋亡及细胞周期相关基因有：fas、bcl-2、bcl-x、cycloxygenase-2、cyclinA、cyclinB1、p34cdc2等，它们在胃癌组织中呈异常表达，广泛参与胃癌发生发展。
四、与胃癌相关的生长因子及其受体基因
    IRF-1、EGF-1、PDGF-A、AgNOR、b -TGF-1、high-mobility-group-1、bFGF、TGF-b II 型受体、TFF2等生长因子及其受体基因在胃癌组织中呈异常水平表达，广泛参与胃癌发生发展。
五、在胃癌组织中呈异常表达的其它基因与蛋白
    还有一些基因在胃癌中检出表达变化，但是既不是癌基因，也不是抗癌基因，但是与胃癌有关,还有一些细菌及病毒亦与胃癌有关。
1、AR基因（amphiregulin）
    AR基因是EGF家族新基因，Shoyab于1988年从诱导的人乳腺癌细胞系MCF-7中得到其编码的84个氨基酸多肽的糖蛋白。AR与EGF和TGF-α在结构和功能上具有明显的同源性，可以结合EGFR刺激自我磷酸化。AR基因启动子区有与SPL一致序列和CRE。研究证明在胃癌组织中SPL水平比正常胃粘膜高，表明SPL可能与AR在癌及正常粘膜的不同表达有关。Kitadai检测了AR mRNA表达情况，发现在8个人胃癌细胞系中，7个以不同水平表达1.4kbmRNA，32例胃癌组织及癌旁粘膜均表达AR mRNA，其中62.5%胃癌AR表达高于正常，尤其在8例T/N>0.5中更明显，表明AR可能参与胃癌发生。
2、Cripto基因
    EGF系统的Cripto基因在44%的早期胃癌中存在过表达，但是此基因功能不清楚，仍需进一步研究。
3 、CD44基因
    CD44基因位于11号染色体短臂上，在淋巴细胞及成纤维细胞中CD44基因能转录出1.6、2.2、5.0kb三种mRNA转录片段。CD44 cDNA读框长1083bp，实际编码361个氨基酸。CD44 mRNA在第222个密码子的第一和第二个核甘酸之间，可插入额外的外显子序列。这些外显子至少有10个，被称为CD44 V区变异体外显子，拼接形式极其复杂。现已发现有多种拼接类型，某些类型的拼接可能与癌细胞的转移相关。CD44已在胃癌组织中表达出不同的变异体，与胃癌的转移密切相关，检测CD44表达对胃癌的预后诊断具有一定的意义。
4、erk基因
    erk基因是EPH家族基因，定位于人染色体1P34-35，1991年从人高分化胃腺癌cDNA文库中克隆出其胞内激酶区cDNA片段，Kiyokawa 用此cDNA片段作探针克隆出其全长cDNA序列。测序结果表明，全长3118bp，开放读框2934bp，编码978个氨基酸残基，与其它EPH家族基因编码的氨基酸序列比较，erk cDNA在氨基端有一个不完全信号肽区，在结构上符合该家族共同特征；在胞外区氨基端有九个半胱氨基酸残基，与IgL有同源性,其胞外羧基端有两个与FNⅢ同源重复单位。ERK蛋白具体功能不清楚，但通过检测其表达方式，可以表明它在细胞信号传导、生长控制及肿瘤发生中起作用。Iwace等采用Northern杂交方法，证明erk在鼠的14-16天的胚胎胃中呈高表达，至18天及刚出生鼠中表达降低，至成年鼠的胃已检测不到。Kiyokawa等研究认为，erk主要在上皮来源的组织（甲状腺，结肠等）及肿瘤细胞系（胃癌，食道癌，结肠癌等）中表达，另外在非上皮来源的骨肉细胞系Hao-310中表达，erk在腺性胃癌中检出75%呈高表达，在肠型胃癌中无异常表达。本室张晓光研究发现erk在katoⅢ、 SGC-7901、 GRC-1、LS174、SMMC-7721、HCG-9204细胞中呈高表达。
    我科王易仑博士于1990年采用差异筛选的方法从胃癌组织中分离出HSGC1差异表达的片段，经Genbank检索为无同源性序列。它的功能还不清楚，仍需进一步研究。
5、与胃癌有关的其它因素
    EB病毒在术后残胃癌中检出比例高达31.4%,表明残胃癌与EB病毒感染具有一定相关性。雌激素诱导的基因PS2 及ERD5在胃癌中呈高表达，示雌激素与胃癌有关。HP是肠型胃癌的危险因素，与慢性胃窦炎及胃癌有关。
    此外，胃癌还涉及E-cadherin,caltractin gene、Trypsinogen、Erk、HEK、MMP-2、MAPK、MKP-1、Protein-tyrosine kinase、protein-serine/threonine等信号转导相关基因及蛋白；还涉及cagA、PCNA、UGTA、copA、MIB、p300、BstUI等蛋白；还涉及免疫因素如IL-4、CD24、CD44、IL-8等；胃癌的转移与nm23、CD44、p53、muc1、cerB-2等密切相关。胃癌相关基因主要以扩增、重排、缺失等方式导致其mRNA及蛋白呈高表达、低表达或不表达，来作用于不同阶段的不同环节，引起转导信号紊乱，导致胃癌发生发展。
六、从细胞株中分离的与胃癌相关基因
    我们从95年开始运用mRNA差异展示技术从事胃癌表达基因的研究，分离出胃癌相关基因片段154个，17个是新序列并被GenBank接受（接受号为AF054162-AF064172，AF071052-AF071058），对其中的二个基因片段进行了cDNA文库的筛选及染色体定位，同时设计了17对引物运用于临床标本的验证及功能性研究，并取得初步结果。
    总之，正常胃粘膜到癌前变再到胃癌过程基因变化的研究还是比较少，胃癌的研究还局限于单个基因在胃癌组织中变化的研究，系统化的研究还是少，只有对正常胃粘膜到癌前变再到胃癌过程基因变化规律进行阐明，才有可能解决胃癌的早期诊断难题。阐明这些基因异常对胃癌发生发展的机理研究具有重要意义。