【摘要】　目的　通过实验和临床研究为肝癌根治性切除后复发转移提供预测指标和预防方法。　方法　用组织块肝原位移植建立高转移人肝癌裸鼠模型，用该模型建立高转移潜能人肝癌细胞系，用分子生物学方法研究肝癌侵袭性有关变化，并由此设计实验性干预治疗。开展预防复发转移的临床实验。　结果　(1)建成在肺、肝和淋巴结高转移的人肝癌裸鼠模型LCI-D20，建成高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97。(2)初步摸清与肝癌侵袭性呈正、负相关的分子水平变化。(3)发现染色体8p缺失与肝癌转移有关。(4)验血提示血栓调节蛋白与肝内播散呈负相关，细胞间粘附分子-1、纤溶酶原激活物受体的抑制剂(PAI-1)和血管内皮生长因子(VEGF)水平与肝癌侵袭转移呈正相关。(5)用LCI-D20 模型，证实TNP470、苏拉明、反义VEGF、突变型flk-1基因转染、羧基胺基咪唑、Endostain、干扰素α等抗血管生成剂有抑制肝癌生长和转移作用。反义H-ras、BB94或肝素也有类似作用。(6)根治性切除后经动脉化学药物治疗(化疗)，化学药物栓塞合并干扰素或LAK细胞治疗使3年复发率有所降低。　结论　肝癌侵袭性相关的分子水平变化与其他实体瘤相仿，小肝癌的生物学特性比大肝癌略好，这些研究为复发转移的预测和预防提供了有潜在意义的线索。

　　肝癌治疗的实质性进展始于20世纪50年代的肝脏规则性切除，60年代肝移植问世，70年代小肝癌局部切除兴起，80年代由于局部和综合治疗的进步使“不能切除的肝癌缩小后切除”成为一个特色，90年代复发转移的研究逐渐成为一个热点。由于肝癌外科的进展始终影响着整个肝癌的预后，因此复发转移的研究也十分引人注目。

　　近年肝癌预后已有进步。比较我所前20年(1959～1978)和后20年(1979～1998年)住院的肝癌病人，其10年生存率已从6.0%提高到31.2%。已有368例生存5年以上，其中10年以上112例。10年生存率(寿命表法)较高者主要有：小肝癌切除963例，为45.9%，大肝癌切除1 308例，为28.3%，和手术证实不能切除的肝癌缩小后切除108例，为43.5%。尽管切除仍为最重要的治疗手段，但切除后复发转移是进一步提高疗效的障碍。我所曾报道肝癌根治性切除后5年复发率为61.5%，小肝癌者也达43.5%^［1］。肝癌的复发转移包括原先切除癌灶的肝内和肝外转移以及多中心发生两方面，本文仅论述前者，其核心是肝癌细胞的“侵袭性”。

　　80年代以来，我所即系统研究肝癌根治性切除后亚临床期复发转移的早期发现、早期诊断与早期治疗^［1，2］。自1994年以来开展了肝癌复发转移的实验性研究^［3］，建立了高转移人肝癌裸鼠模型和细胞模型^［4，5］，在分子水平研究了肝癌侵袭性有关的因素及临床防治措施^［6-9］，最近还发现染色体8 p的缺失与肝癌转移有关^［10］。近年特别在肝癌血管方面进行了较多的工作^［11-14］，探索了复发转移的实验性干预^［15］。以下仅就我所近年肝癌研究报告如下。

材料和方法

　　一、高转移人肝癌裸鼠模型和细胞系的建立

　　我所虽在1982年建成人肝癌裸鼠模型(LTNM)(上海医科大学学报1982，9：21-26)，但此模型从不转移，无法用于研究肝癌转移。为此根据“种子与土壤”学说，选用手术中转移癌灶，用完整组织块肝原位移植来建立高转移人肝癌裸鼠模型。裸鼠模型建立后，再用该模型的癌建立高转移潜能人肝癌细胞系。

　　二、肝癌侵袭性的分子水平研究

　　主要用分子生物学和免疫组织化学的方法，对肝癌手术切除标本进行研究，少数用病人血进行研究。关于染色体与转移关系的研究采用比较基因组杂交技术(CGH)。关于肝癌侵袭性，由于目前尚无客观标准，通常采用门静脉癌栓的有无、肝内有无播散结节等作为划分。部分用病人血作复发转移预测指标的研究，通过对近年的病例分析，找出主要影响预后因素(肝癌体积与门静脉癌栓等)，然后以此划分“高、低转移倾向”组。

　　三、肝癌血管生成的研究

　　主要用CD34单抗染色作微血管密度(MVD)的研究，用裸鼠角膜微囊癌组织移植诱导新生血管，然后血管计数比较。同时还包括对VEGF、PD-ECGF、b-FGF等的测定。

　　四、复发转移的实验性干预

　　主要采用LCI-D20裸鼠模型，观察各组癌重、肺转移情况等。为了模拟临床肝癌根治性切除后的复发转移，部分实验在癌肝内接种10 d后再开腹将含癌的部分肝切除，然后观察各组肝内癌复发和肺转移情况。所用的干预方法主要根据分子生物学研究的结果而设靶，分别采用反义寡核苷酸(如反义H-ras、反义VEGF)、转移相关环节的抑制剂(如基质金属蛋白酶抑制剂BB94)、抗血管生成制剂(如TNP470、苏拉明、羧基胺基咪唑、Endostatin、干扰素等)、分化诱导剂(如维甲酸)等。

　　根治性切除后预防复发转移的临床分组试验：将肝癌根治性切除后的病人分成几组，分别在术后采用经动脉化学药物治疗(每2个月用1个疗程，平均3个疗程)，化学药物栓塞合并干扰素(术后1个月和术后5个月共进行2次TACE)，或IL-2／LAK细胞治疗，观察3年复发率。

　　五、其他

　　包括血清学的预测指标研究、复发的治疗研究等。

结果与讨论

　　肝癌转移源于癌细胞遗传特性的改变，这些改变使细胞与细胞间、细胞与细胞外基质(ECM)间失去粘附力，使细胞的运动与增殖能力增强。肝癌细胞能分泌降解ECM的酶，从而得以穿过基底膜和ECM，进入血管。进入血管后又要能抵御T淋巴细胞等的攻击，到达靶器官。然后在靶器官的血管壁附着；再降解ECM，穿出血管，在靶器官增殖。肝癌分泌血管生长因子，使肝癌血管形成，转移癌灶得以发展并危害机体。国际上在实体瘤转移方面进行了几十年的研究，我所自1994年起对上述主要环节进行了一些研究，证实文献提到的诸多因素在肝癌复发转移过程中几乎都存在，并获得一些文献上尚未见报道的结果^［3-15］。

　　一、肝癌复发转移的实验研究

　　1.人肝癌高转移裸鼠与细胞模型的建立与研究：开展肝癌复发转移实验性研究，需要有裸鼠人肝癌高转移模型和高转移潜能的人肝癌细胞株。关于裸鼠模型，我所将30例肝癌手术切除标本的组织块原位移植于裸鼠肝脏，仅获得1株裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)，为国际上首例^［4］。此模型的肝内、肺和淋巴结转移率可达100%，其染色体90%为异倍体，已传100余代，仍保持转移的特性，是研究肝癌转移的良好模型。与同时建立的低转移裸鼠模型(LCI-D35)比较，与侵袭性相关的c-fos、c-jun、N-ras、H-ras和p53基因等异常表达均明显高于后者(P＜0.05)。随着LCI-D20癌体的增大，PAI-1亦随之上升。裸鼠角膜微囊模型提示，LCI-D20癌组织比LCI-D35癌组织能诱发更多的新生血管。此外还建成接种于裸鼠肝脏出现肺转移的MHCC97细胞系。MHCC97细胞系的中位染色体数为60～61，i(1)(q)和der(4)(pter → q35)等为其标志染色体^［5］。

　　2.肝癌复发转移的分子机理^［6-9］：我所研究表明，与肝癌侵袭性呈正相关的癌基因、抑癌基因、生长因子等有：p16(CDKN2)突变、p53突变、p21(ras)、mdm-2、c-erbB-2、TGFα(转化生长因子α)、EGFR(表皮生长因子受体)、VEGF、MMP-2、ICAM-1、uPA(尿激酶型纤溶酶原激活剂)及其受体uPA-R与抑制剂PAI-1等。如有肝内播散的肝癌其p16突变率达64.3%，而无肝内播散者则仅为10%；侵袭性肝癌p21的阳性率为43.2%，而非侵袭性肝癌仅16.7%；有复发转移的肝癌p21的阳性率达38.6%，而无复发转移者则为0%；有肝内播散的肝癌p53突变的阳性率达73.7%，而无肝内播散者则仅33.5%。与侵袭性呈负相关者如：nm23-H1、Kai-1、TIMP-2(金属蛋白酶的组织抑制剂-2)、整合蛋白α5(Integrin α5)和钙粘蛋白(E-Cadherin)等。关于肝癌细胞侵袭性的分子水平研究可以归纳为以下几点：(1)肝癌与其他实体瘤的情况基本相同。(2)小肝癌的侵袭性略小于大肝癌。与大肝癌相比，小肝癌中具有高侵袭性的比率略低，而低侵袭性的比率略高，但差别并不太大，说明即使小肝癌也同样存在生物学特性的差异。

　　3.染色体遗传特性改变与肝癌转移：为了进一步弄清肝癌转移的遗传机制，对10例病人的原发癌和该病人的转移癌采用CGH方法研究其基因改变的异同。结果发现染色体的改变包括8p、4p、17p和19p的丢失，5p的获得，并在两例以上观察到1q12-q22的扩大。其中最有意义的发现为8p的丢失。8例转移灶均可测得8p的丢失，而原发癌仅3例有8p的丢失。说明染色体8p的丢失可能与肝癌转移有关^［10］。这项研究也提示使用CGH的方法对原发癌及其转移灶作对比研究可望测出与转移有关的特异的遗传学改变，而这正是肝癌转移研究的关键所在。

　　4.肝癌血管形成的研究^［11-14］：由于肝癌大多为多血管型肿瘤，为此研究肝癌血管有重要意义。已发现VEGF mRNA与肝癌侵袭性密切相关，有癌栓者VEGF mRNA水平高于无癌栓者（P＜0.05）。PD-ECGF也相仿。用抗CD34染色测定微血管密度(MVD)证明少血管型小肝癌的5年无癌生存率为多血管型者的1倍，为74.6%对34.7%。关于实验性干预，应用上述LCI-D20模型，已探索了几种抗肝癌血管制剂：(1)证明苏拉明(Suramin)可抑制肝癌和转移，与对照组比，肝癌体积分别为7.5和10.8 cm³，肺转移率分别为62.5%和100%。(2)同样，肝癌血管抑制剂TNP-470也有相仿结果，癌重分别为0.97 g和2.04 g，肺转移率分别为8%和50%。(3)为证明VEGF及其受体flk-1在血管生成和肝癌进展的关系，通过突变型flk-1基因转染也发现可抑制血管生成，从而抑制肝癌和转移。肝癌比对照组小10倍；肺转移率分别为20%和100%；肝癌血管很难看到，而对照组则血管丰富。反义VEGF也有类似作用。(4)最近还证明endostatin有明显抑制肝癌的作用，合用顺铂可增效。肝癌体积(mm³)对照组为8376，单用endostatin为3777，单用顺铂为1629，而endostatin与顺铂合用则为463。(5)最近还发现，大剂量长疗程干扰素α1b在模拟手术切除后复发的模型中有明显预防肝癌复发和肺转移的作用，在癌灶形成后也有治疗作用，而且疗效与剂量相关。

　　5.其他实验性干预治疗^［15］：除上述针对肝癌血管的干预治疗外，还在LCI-D20模型探索了以下方面：(1)反义H-ras寡核苷酸可特异抑制H-ras的表达，诱导细胞凋亡，在体内和体外抑制LCI-D20细胞及其在体内的成癌性(为50%对100%)，并减少肺转移率(0%对100%)。(2)证明肝素可抑制肝癌生长和肺转移。与对照组比，肝癌直径为(1.50±0.61) cm对(2.98±0.50) cm；肺转移率分别为20%和60%；50 d生存率分别为60%和0%。(3)金属蛋白酶抑制剂BB94也有相仿作用。与对照组比，癌重分别为2.27 g和3.13 g，肺转移率为44%对100%，45 d的生存率为100%和56%。(4)实验未能证实单独应用全反式维甲酸对LCI-D20模型肿瘤的生长与转移有何影响。

　　二、肝癌复发转移的临床研究

　　1.复发转移的预测^{［3，10，11］}：在切除前或切除后短期内如能预测复发转移的危险性，当有助预测预后，并采取相应对策。预测指标主要有血的检测和切除标本的研究。血的检测方面发现：血栓调节蛋白(Thrombomodulin,ELISA法)与门静脉癌栓形成和肝内播散呈负相关，高转移倾向组病人血浆DNA中D14S62和D14S51(14q染色体)杂合性丢失(LOH)的阳性率低；基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、细胞间粘附分子(ICAM-1)、纤溶酶原激活物受体的抑制剂(PAI-1)和血管内皮生长因子(VEGF)水平与肝癌侵袭转移呈正相关。在切除标本检测方面：基质金属蛋白酶(MMP-2)如在癌的表达高于肝癌周围肝组织，则预后差；有p53突变者复发率高、生存率低。上皮钙粘蛋白(E-cadherin) mRNA转录指数与肝癌转移性呈负相关。总之，尽管已经发现了一些线索，但要开发出符合临床需求的敏感、简便易行、价格低廉的检测方法，仍需作大量工作，而且上述这些指标均非肝癌所特有的。

　　2.肝癌复发转移的治疗^［1，2］：比较成熟的治疗仍为再切除，不宜切除者可作经导管动脉内化疗栓塞(TACE)和经皮无水乙醇注射(PEI)。我所对复发做再切除154例，5年生存率(自第1次手术起算)为56.1%，复发做冷冻等姑息性外科治疗者37例，5年生存率为44.4%。这是在更新的疗法出现前能延长切除后生存期的有效途径。

　　3.肝癌复发转移的预防^［16］：就临床而言，如能预防复发是再理想不过的。我所105例根治性切除后，经手术中安放的肝动脉和(或)门静脉插管化疗(每隔2～4个月重复1次)，3年复发率18%。另68例根治性切除后化学药物栓塞(隔5个月1次，一般2次)合并干扰素治疗，3年复发率15%。第3组56例术后LAK／IL-2治疗，3年复发率为11%。均低于我所过去报道的32.5%。但究竟是降低了复发率抑或推迟了复发的时间，尚待进一步随访。

小结

　　肝癌复发转移的临床研究才刚开始，至今证明各种实体瘤的复发转移规律在肝癌也适用，但肝癌的特殊规律还没有找到，最近我所和美国国立卫生院(National Institutes of Health, NIH)合作，发现染色体8p丢失很可能与肝癌转移有关，但要获得与肝癌转移的相关基因是一个十分困难的问题；尽管在分子水平上已发现不少线索，但距临床实际应用还有很长的路要走。无疑生物学、特别是分子生物学的研究将起重要作用，但利用现有的办法进行临床干预也不可偏废。