原发性肝癌的肝组织活检

    在近几年里，采用实时超声或CT导引下活检或细针穿刺行组织学或细胞学检查，是目前获得2cm直径以下小肝癌确诊的有效方法。但近边缘的肝癌易引起肝癌破裂，此外，并有针道转移的危险。若AFP明显升高，加上典型超导图像可初步诊断原发性肝癌;对AFP阴性或低浓度者应适当选择AFP以外的肝癌标志物，影象诊断亦有定性、定位诊断价值，CT检查造影剂增强或动态增强扫描，有助于肝癌诊断。磁共振的特征性表现可助肝癌的诊断和鉴别诊断，放射免疫显象诊断有较高特异性。微小肝癌的诊断和与某些小的良性病变的鉴别尚有待深入研究。
    肝癌的实验室检查指标主要包括肝癌标志物、肝功能、肝炎病毒标志物、免疫功能指标等。
    1.肝癌标志物　理想的肝癌标志物，应该是存在于患者血清中，具有高度的灵敏度和特异性，而且能正确反映其负荷程度，使之能用于辅助诊断、治疗结果评估、预后判定、复发与否的标志。①甲胎蛋白(AFP)：众所周知，AFP是当前诊断肝癌很有特异性的标志物，但仍存在30%～40%的假阴性和2%假阳性问题。目前文献已报道的肝癌标志物达数十种之多，主要为以下几类：AFP、AFP单抗、AFP异质体。②血清酶：γ-谷氨酰转肽酶(GGT)及其同工酶、岩藻糖苷酶(AFU)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、醛缩酶同工酶A(ALD-A)、碱性磷酸酶同工酶Ⅰ(ALP-Ⅰ)、5’-核苷磷酸二酯酶同工酶V(5-NPP-Ⅴ)、丙酮酸激酶同工酶(PyK)、胎盘型入赘孰腟-转移酶(GST)等。③其他标记物如异常凝血酶原(DCP)、铁蛋白和酸性铁蛋白等。在寻找新的更有效的特异性肝癌标志物同时，人们也对肝癌已有的多种标志物进行优化筛选、择优组合、综合观察，大大提高了肝癌诊断准确性。
    (1)AFP类标记物：
    ①AFP已成为目前肝癌诊断很好的标记物：自从1956年发现AFP，1964年证实从肝癌病人血清中可以检测出AFP，并在20世纪60年代末广泛应用于临床以来，AFP已成为目前肝癌诊断很好的标记物。AFP由Bergstrand和Czar于1956年在人胎儿血清中首次发现，为一种胚胎专一性甲种球蛋白，由胚肝实质细胞和卵黄囊细胞合成。胎儿从6周开始血中出现AFP，至12周时达很高峰，含量在4g/L以上。出生5周后血清中AFP用常规方法已不能测出。放射免疫法测定正常人为1～20μg/L。1963年，Abelev首先发现小鼠接种肝癌可合成AFP，随后Tatarinov在原发性肝癌患者血清中检测到AFP，并由此广泛地应用于临床和普查。此外，妊娠、活动性肝病、生殖腺胚胎性肿瘤、继发性肝癌和消化道癌中的少数也可呈血清AFP阳性。1977年，全国第1届肝癌协作会议提出单项AFP检测诊断原发性肝癌的标准：AFP对流法阳性或定量≥400μg/L，持续2个月以上，并能排除妊娠、活动性肝病、生殖腺胚胎性肿瘤者。将AFP检测用于自然人群和高危人群普查以来，经大量研究证明AFP能够提高亚临床期肝癌的检出比例，从而使肝癌患者获得的早期诊断、早期治疗的机会明显提高，五年生存的可能以数倍上升，成为目前检测肝癌很有特异性的肿瘤标记物。AFP是由590个氨基酸组成的糖蛋白，糖分占4%，分子量为6.4万～70万，等电点4.75，沉降系数4.55，半衰期为3～7天。不同组织来源的AFP糖分及糖链结构存在异质性。分子结构大体相同，不同糖链或蛋白质等电点的AFP称为AFP异质体(AFP variant)。AFP异质体可利用外源性植物凝集素和AFP糖链结合能力的差异进行分离。
    ②AFP的检测方法：有琼脂扩散法、对流免疫电泳法、血凝法、放射免疫测定、火箭电泳自显影、酶联免疫法等。其中扩散法和对流法因不够敏感而较少采用。
    ③AFP的临床应用价值：
　A.AFP为临床诊断原发性肝癌高度专一性的指标：临床发现约60%～70%的原发性肝癌AFP升高，如按标准诊断，假阳性比例仅为2%。
　B.鉴别诊断原发性肝癌与其他肝病：原发性肝癌患者血清中AFP常持续500μg/L以上，ALT多正常或轻度升高。或AFP呈低浓度阳性，但多呈不断上升或持续不变或呈马鞍型改变，且与ALT动态变化不一致。而慢性活动肝病患者血清中AFP含量很少在400μg/L以上，AFP升高常为一过性的，不超过2个月，且与ALT变化相平行。检测AFP异质体更有利于鉴别。扁豆凝集素(LCA)结合型AFP在慢性肝炎、肝硬化患者中只占AFP总量的3%～6.3%，而在原发性肝癌中占45%～47.8%。以LCA结合型AFP的百分含量≥25%作为肝癌诊断标准，敏感性为73.5%～84.3%，特异性为97%～98.6%。
　C.提高早期诊断比例：能在肝癌临床症状出现前6～12个月作出诊断，通过普查，早期发现肝癌。上海市197l～1976年普查196万人，检出300例，其中亚临床肝癌134例，占44.4%。
　　D.评价手术或其他诊疗理念的治疗结果，判断预后：AFP阳性肝癌完全医治性切除的，AFP在术后1～2个月内转阴。术后AFP不能降至正常或降而复升者，提示有癌细胞残存。是反映病情动态变化和评估治疗结果的敏感指标，观察肝癌患者经其他诊疗理念后的AFP变化，亦可判断治疗结果和估计预后。
　　E.早期发现术后复发与转移：术后每月用AFP及B超监测随访，可早期发现复发癌以便及时治疗。两年后检查的间隔时间可相对延长。能检出完全医治性切除术后亚临床期复发与转移。
　　④肝癌诊断标准：1977年制订的肝癌诊断标准为如无其他肝病活动依据，排除妊娠和生殖腺胚胎性肿瘤，AFP≥500μg/L持续1个月或AFP≥200μg/L持续2个月者即可诊断肝癌。近年来，结合影像学检查对肝癌诊断的标准又进行了补充。1990年全国肿瘤防治办公室和中国抗癌协会合编的《中国常见恶性肿瘤诊治规范原发性肝癌》补充如下：
　　A.如无其他肝病依据，对流法或放射免疫法AFP>400μg/L持续4周以上，并能排除妊娠、活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤及转移性肝癌者。
　　B.影像学检查有明显肝实质性占位病变，能排除肝血管瘤和转移性肝癌，并具有下列条件之一者：a.AFP≥200μg/L;b.典型的原发性肝癌影像学表现;c.无黄疸而ALP或GGT明显增高;d.远处有明确的转移性病灶或血性腹水，或在腹水中找到癌细胞;e.明确的乙型肝炎标志阳性的肝硬化。
　　⑤非癌性肝病AFP的增高：除了原发性肝癌以外，AFP在非癌性肝病，特别是病毒性肝炎及肝硬化，常存在一过性增高(见表2)。研究资料显示：在非癌性肝病中，AFP浓度多在200μg/L以下，且为一过性，产生AFP升高的机制与肝细胞的再生有关。此外，肝炎病毒对AFP合成基因的去抑制作用也可能是AFP增高的机制之一。由于肝癌多数是在慢性肝病基础上发生，所以对AFP水平较高的肝病患者需警惕合并肝癌的可能性。从上述资料来看，非癌性肝病AFP多在200μg/L之下，且多呈一过性，而肝癌多在200μg/L以上，呈持续性高峰或动态上升，所以动态观察AFP浓度变化，结合影像学检查，基本上能得到正确的诊断。在其他疾病如胚胎癌、胃癌等肿瘤中，有时AFP也明显增高，给临床诊断造成一定的困难。少数消化道癌，特别是继发肝转移的胃癌，其中约15%的患者AFP阳性，但绝大多数AFP水平在100μg/L以下，仅1%～2%的患者可高于200μg/L，很高者可达120000μg/L以上。如果切除了肝癌原发灶即使保留转移灶，AFP也可以降至正常水平。
　　(2)AFP异质体：AFP是一组糖蛋白，在原发性肝癌、继发性肝癌、胚胎细胞瘤和各种良性肝病中增高的AFP，其糖链结构有所不同。应用外源性凝集素结合的AFP分子，可以形成具有各种不均一性的分子异质体，部分异质体AFP与刀豆素A(ConA)有亲和性，另一部分则与扁豆凝集素(LCA)有亲和性。因此将AFP分为ConA亲和型和不亲和型，LCA亲和型与不亲和型。通过异质体分析，可以鉴别各种AFP增高性疾病。有资料表明，根据异质体不同含量能够鉴别良恶性肝病，肝癌阳性检出比例高达85%以上，但应注意良性肝病约有30%假阳性。在肝癌和胚胎性肿瘤的研究中发现，肝癌AFP以ConA亲和型为主，而畸胎瘤和胃癌肝转移则以ConA不亲和型为主。
　　(3)异常凝血酶原(DCP)：凝血酶原前体在缺乏维生素K或服用维生素K拮抗剂后不能转化为凝血酶原而释放入血中，即为异常凝血酶原(abnormal prothrombin，AP)。其N端的谷氨酸残基未经羧基化，故又称脱羧基凝血酶原(descarboxy prothrombin，DCP)。它在一般凝血试验中无活性。正常人血浆不存在异常凝血酶原。1984年发现肝癌病人可测得DCP，可能为肝癌标志物。原发性肝癌患者血清中DCP升高与胆道梗阻或其他原因引起维生素K缺乏所致的DCP升高不同，两者可通过维生素K治疗试验加以鉴别。与AFP比较而言，DCP作为单项肝癌标志物，阳性比例为67.3%，但异常凝血酶原由良性肝病引起的假阳性比例则较AFP低，故在鉴别良性肝病时优于AFP，两者合用可减少假阳性，因此可用于鉴别良、恶性肝病。在AFP阴性的肝癌中，DCP阳性比例仍保持高水平，阳性比例可达61.9%，所以它有助于AFP阴性肝癌的诊断。小肝癌患者血清DCP阳性比例仅19%，直径3～5cm肝癌患者阳性比例约55.6%，大肝癌则达66.2%，而慢性肝病DCP阳性比例仅为14.8%，所以DCP虽对肝癌的诊断与鉴别诊断有帮助，但对肝癌的早期诊断尚不够理想。
　　(4)α-L-岩藻糖苷酶(α-L-fucosidase，AFU)：AFU是一种广泛存在于人和动物组织液中的溶酶体水解酶，参与糖蛋白、糖脂等多种生物活性物质的分解代谢。可用分光光度比色法或荧光比色法检测其活性，正常值为450mmol/(ml·h)。肝细胞癌患者血清中AFU活性显著高于肝硬化和继发性肝癌，对原发性肝癌诊断的敏感性为75%，特异性90%，对AFP阴性肝癌的阳性检出比例为80.8%。但AFU高亦可见于病毒性肝炎、糖尿病、突眼性甲状腺肿及胃肠道癌肿。
　　(5)碱性磷酸酶(ALP)同工酶：ALP在各种阻塞性黄疸患者血清中都可升高，肝癌患者80%～90%ALP升高，小肝癌约10%阳性，但缺乏特异性。ALP同工酶Ⅰ(ALP-Ⅰ)对肝癌诊断相对特异，但阳性比例较低，仅为24.8%，由于其敏感性不高，不宜作为肝癌的筛选指标。由于原发性或转移性肝癌均能引起梗阻性黄疸，ALP浓度与梗阻程度、持续时间呈正比，因此，在鉴别诊断中应综合分析，加以判断。
　　(6)5’核苷酸磷酸二酯酶同工酶Ⅴ(5’-NPDV)：5’-NPDV可出现在肝癌患者血清中，在AFP阳性肝癌中阳性比例达84.6%～85.7%，在AFP阴性肝癌中为56.4%～91.0%，但特异性不高，在肝脏良性病变和转移性肝癌中均可出现，特别是后者，其阳性比例可达83%。
　　(7)GGT同工酶：肝癌患者GGT阳性比例高达90%以上，但缺乏特异性，其中有三种肿瘤相关的同工酶(Ⅰ’、Ⅱ’、Ⅲ’)统称为GGT-Ⅱ，肝癌患者阳性比例为79%，AFP阴性肝癌和小肝癌的阳性比例分别为84.0%和78.6%。近年开展的GGT-Ⅱ定量测定，阳性诊断比例有一定提高。目前认为GGT-Ⅱ对肝癌仍有较大的诊断价值。
　　(8)铁蛋白与同工铁蛋白：铁蛋白经等电聚焦法和聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为A、B、C三种，分别是碱性、中性和酸性铁蛋白。总铁蛋白对肝癌诊断特异性不高，而酸性铁蛋白多由肝癌细胞产生，特异性相对高，肝癌患者阳性比例约为80%。
　　(9)醛缩酶(ALD)同工酶：ALD是糖酵解过程中果糖分解的关键酶之一。A型来自肌肉，B型来自肝脏，C型来自脑组织，胎儿期主要是A型。原发性肝癌时ALD-A升高，阳性比例为76%。转移性肝癌及其他消化道恶性肿瘤，如腺癌等也见升高。ALD-A阳性比例不高，且缺乏特异性。
　　(10)丙酮酸激酶同工酶(M2-PyK)：丙酮酸激酶(PyK)是糖酵解过程中的关键酶。它有L、R、M1和M2四型同工酶。肝细胞癌患者M2-PyK阳性比例可达93%，而良性肝病大多正常。其他消化道恶性肿瘤、肌肉疾病及溶血性疾病也可见M2-PyK升高。
　　(11)谷胱甘肽S-转移酶(GST)：肝癌患者血清中GST为正常人的25倍，肝癌诊断阳性比例为89.5%。而在慢性肝病患者中较低，有助于肝癌与良性肝病的鉴别。
　　(12)αl-抗胰蛋白酶(αl-AT)：αl-AT为肝细胞合成的蛋白酶抑制剂。对原发性肝癌的诊断阳性比例可达86.7%，但特异性仅为50%。在炎症性肠病、良性肝病均可增高，假阳性比例较高。
　　其他标志物：其他肝癌标志物有α1-AAT、α1-AAT异质体，假尿苷、CA19-9、CA50等。它们对肝癌的灵敏度和特异性均较高，但不能有效地、特异地区分原发性和继发性肝癌。近年报道血清Ⅳ型胶原在肝脏良、恶性肿瘤中有鉴别诊断价值，准确性达90.8%，对肝癌的敏感性和特异性分别为91.48%和89.65%，与AFP联合测定，敏感性可达95.74%。
　　(13)AFP mRNA近年的研究揭示，肝癌患者血清中还可以检出一些与转移密切相关的物质，这些物质可以作为对肝癌转移与否，病程进展与预后的判断指标。　
　　(14)CD44v mRNA CD44v是存在于细胞表面的黏附分子，参与细胞-细胞和细胞-间质之间的反应。CD44v是指标准的CD分子被至少5个外显子以不同的组合剪接而成。单个细胞可以表达2个或更多的CD44v，它们能使肿瘤细胞黏附在宿主细胞外间质或基底膜上，促使癌细胞发生侵袭转移。
　　肝癌细胞存在多种CD44v，通过特异性结合扩增肿瘤CD44v引物，检测外周血清中的CD44v mRNA，可以判断外周血中是否有肝癌细胞存在以及这些癌细胞侵袭能力的大小。所以CD44v mRNA也可以作为判定肝癌预后和转移的标志。
　　国内刘鹏飞等报道，在66.7%(10/15例)的肝癌血清中可以检测到CD44v mRNA，经手术切除癌肿后，CD44v mRNA阳性组复发的可能达100%，而阴性组仅为25%。在AFP阴性肝癌患者中，CD44v仍有阳性表达，提示CD44v在肝癌的诊断及监测术后复发方面可作为AFP重要的互补指标。
　　(15)细胞间黏附分子-Ⅰ：近有学者发现肝癌细胞表面一种物质-细胞间黏附分子-Ⅰ在肝癌细胞中稳定表达，当肝癌细胞发生转移时，其表达量可成倍增高。所以，细胞间黏附分子-Ⅰ有望成为新的肝癌转移标志物。由于肝细胞可以合成白蛋白，所以检测外周血白蛋白mRNA亦可以作为预测肝癌转移的参考指标。