显微切割技术

在分子病理学研究中，常常遇到两个比较棘手的问题，一是选取的研究材料需要在某一方面具有相同的特征，即具有一定程度的同质性，例如我们想通过蛋白质印迹的方法定量研究淋巴组织中CD4阳性和CD8阳性细胞内某种信号传导分子的表达水平，那么我们首先就必需分别选取分离淋巴组织中CD4阳性和CD8阳性的同质细胞，再进行后续的蛋白提取与检测，而我们人体的各种组织绝大多数是由多种不同细胞组成的异质性的细胞群，这种选取同质性的研究材料问题在对人体组织的深入研究中常常遇到却又不易解决；二是随着研究的不断深入需要在组织细胞中分离的研究材料日趋微小，常规手段往往不易做到，例如要收集分离组织内的单个细胞或细胞内的特殊组分如核仁或包涵体或染色体的某一区带等。显微切割技术（microdissection technique）可以很好地解决以上问题,因而受到高度重视并得以广泛应用，本文谨就此技术作一简介。

显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。显微切割技术实际上属于在微观领域对研究材料的分离收集技术，因此应用此技术往往是许多要深入的研究工作中起始的重要一步。以下就显微切割技术的特点、方式、材料、结合技术、影响因素和最新进展作简要叙述。

一、显微切割的特点

显微切割技术的特点可以概括为以下四方面：一是“细微”，由于是在显微状态并采用特殊的分离收集手段，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和包涵体及染色体特异区带这样细微的对象；二是“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。例如何杰金氏淋巴瘤中瘤组织成分多样,特征性的瘤细胞(R-S细胞及其变异型)占细胞成分的2%左右,且呈散在性分布,如果常规地用组织匀浆的方式从组织中提取蛋白质或核酸，则既包含了来自瘤细胞的成分，又包含了来自淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、组织细胞等多种非瘤细胞的成分,这样所提的蛋白质或核酸来自何种细胞并不清楚，而如果用显微切割技术则可以选择我们需要的细胞，以使研究对象的历史背景明确；三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性，例如前面提到的它可以收集CD4或CD8阳性的同质细胞；四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。正是由于显微切割技术具有上述特点或者称为优势，其在分子病理学研究中的应用十分广泛。

二、显微切割的方式

显微切割的历史实际上可以追溯到本世纪六十年代。1965年，Baxter TJ就曾用显微切割技术对肾小管进行了研究，但当时显微切割的手段还比较落后，制约了其在医学研究中的广泛应用。随着技术的不断发展，显微切割也出现了多种方式，依其发展的过程可以分为以下四种：手动直接显微切割、机械辅助显微切割、液压控制显微切割和激光捕获显微切割（Laser Capture Microdissection）。这些方式各具特色,不同实验室可根据各自条件进行选择. 手动直接显微切割是早期的切割方式，它是直接在显微镜下手持切割用针分离组织或细胞群，此种方式切割精度低，只适用于对较大块组织中的局部区域或细胞群进行分离，切割单个细胞十分困难；机械辅助显微切割是利用普通光学显微镜的微调旋钮控制切割针切割细胞,可采用30G1/2注射用针替代需要专用拉丝设备制作的玻璃切割针,此方式切割精度较手动直接显微切割的精度有了提高，可以达到对较大的单个细胞的切割，而且此方式简单易行低耗,尤其适合于基层和无专用设备的单位，但由于显微镜的微调旋钮只能进行二微控制，对切割后的细胞进行收集较为困难，且切割精度仍然较低；液压控制显微切割是采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割，目前常用的操纵系统有日本的Narishige和德国的Eppendorf液压显微操纵系统，该系统同时可用在转基因动物及显微注射等实验中，它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确的三微控制，其切割精度是目前各种方式中最高的，也是很多实验室常用的方法，其不足是不能实现显微切割的自动化,要收集较大量的目的组分时耗时长，效率低；激光捕获显微切割是目前最为先进的方式,它快速方便,可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分,自动化程度高,但这需要昂贵的专用设备。

三、显微切割的材料

显微切割的材料可以是以各种方式贴附于固相支持物上的各种组织细胞成分，其来源十分广泛，石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩片、培养细胞、常规制备的染色体等均可采用。具体选择何种材料根据研究目的的不同进行，如果显微切割后需要进行RNA分析则通常采用冰冻组织切片或新制备的细胞片；在回顾性研究中福尔马林固定石蜡包埋的组织切片应用最为广泛。

四、显微切割的结合技术

显微切割时究竟选择什么样的细胞完全取决于研究的目的，但如何识别欲切割的细胞及如何对已切割的细胞进行分析，则需要和其它方法相结合。正是由于能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术结合应用使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记，显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。

五、显微切割的影响因素

由于显微切割常常是与多种方法结合使用，影响显微切割实验最终结果的因素也就多种多样。这就需要在实验过程中把握一个原则,即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素，在实验的过程中予以考虑。与不同的方法结合决定了需要对显微切割的材料进行不同的处理，如显微切割后需要进行RNA的相关分析，则所有过程必需确保无RNA酶的降解干扰;如显微切割后需要进行基因组DNA的相关分析,则应该保持基因组的相对完整性,避免在样品处理过程中造成DNA的降解和断裂,这就需要选择合适的方法进行样品的固定和保存,例如在福尔马林固定石蜡包埋的组织中由于固定包埋剂的影响存在较多的DNA断裂,而且随着保存时间的延长,DNA的断裂越多,因此欲分析的DNA需要保持完整时,选择石蜡切片进行显微切割则不合适;如果要对石蜡组织切片显微切割后进行PCR分析,则设计引物时应注意使其决定扩增的片段长度不要太长,一般在保证特异性的前提下,最好选择扩增片段长度200bp以下的引物。

运用显微切割技术时应该分离多少细胞或亚细胞才能满足实验研究的需要,这要受多种因素的影响.例如单细胞显微切割用于DNA分析所需的单个细胞数，依研究目的、标本固定方式、切片厚度、细胞大小、DNA提取方式、PCR扩增片段长度的不同而有差异。Dietmaier等比较了用流式细胞仪分选细胞和用显微切割从冰冻切片和石蜡切片上切割单个细胞用于突变分析所需的最少细胞数的差别，结果冰冻切片与流式细胞仪相同，至少需要10个细胞，而石蜡切片一般需要30个细胞。如果要分析切割细胞中病原微生物的DNA情况，则细胞内病原体的拷贝数越多，需要的细胞数越少。冰冻组织切片较石蜡组织切片更适宜于对细胞基因组DNA的分析。在不影响形态观察的前提下，作为显微切割的组织切片越厚越好，对于石蜡组织一般主张选用7?m的连续切片较为适宜。分析基因组DNA时，细胞越大，则需要切割更多的细胞，才能保证包含细胞的全部基因组。从显微切割的细胞中提取DNA多采取直接法，即采用蛋白酶K消化后再加热灭活酶的方法，这样可以减少在提取过程中DNA的丢失。在采用激光捕获显微切割时或可以切割较多的细胞时，也可采用酚氯仿抽提的常规方法提取细胞DNA。由于如前所述的石蜡组织中存在DNA的断裂，如果要对其切割的细胞进行PCR分析，则扩增的片段越长，需要切割的细胞数越多。

六、显微切割的最新进展

显微切割技术的进展主要体现在激光捕获显微切割技术的广泛应用，此项显微切割技术开创了细胞分离技术的新纪元。借助于这一革命性技术，我们可以快速地精确识别和特异分离单个或群体细胞用于进行下一步的细胞及分子生物学研究，其精确识别是在显微镜下通过细胞形态、免疫组织化学染色及组织化学染色等方法并有计算机辅助实现，而特异分离则是通过低能量红外激光及专用的细胞转移膜实现。激光捕获显微切割是通过激光显微细胞分离系统实现的，该系统由倒置显微镜、红外激光发射器、真空泵、细胞转移膜及计算机组成。通过显微镜载物台中真空泵固定载玻片，通过附着在离心管盖底的超薄细胞转移膜将由红外激光分离挑选出的细胞转移到离心管中，并可以直接被离心管中的提取液所溶解和提取，其提取液的性质可以根据您所提取的细胞组分而自行决定，而且所有的细胞分离过程，无论是转移操作还是保存样品，都无需任何手工操作，可以实现无污染的细胞分离。目前的激光显微细胞分离系统通常能够提供三种规格的激光光束直径，它们分别是小于7.5µm、15µm和30µm，小于7.5µm光束可以分离挑选单一细胞，15µm和30µm 光束则可以分离挑选较大区域，从而可以保证系统具备较高的准确性和效率以实现对特定细胞或细胞亚群的分离挑选，分离前后及被捕获的细胞图象以统一的数据库格式贮存于计算机中。

近年来，激光捕获显微切割技术在分子病理学研究中的应用不断深入，特别是在肿瘤基因突变检测、肿瘤特异基因表达分析、杂和性丢失检测、微卫星序列不稳定性分析、新基因发现、核酸及蛋白质的定量研究、染色体畸变分析、细胞局部病变病因学研究等多种领域进行了广泛应用，取得了许多本技术诞生前无法实现的新研究成果。

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