细胞凋亡的最新研究进展

-----凋亡信号转导途径及其基因调控

1. 前言

普遍认为细胞凋亡在肿瘤和其它疾病中具有重要的意义，目前在很多生物学领域进行广泛的研究。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细胞凋亡发生分子机理的了解越来越透彻，然而也发现这一过程远非原来想象的那样简单，而是包含了复杂的调控机制。尽管仍有许多问题甚至是关键的问题没有搞清楚,但近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制以及细胞凋亡的基因调控等方面都取得了显著的进展。本文旨在对近几年来对细胞凋亡的最新进展中的几个活跃领域做一回顾，它们包括：一、细胞凋亡进程中重要的执行者（Executioner）Caspases(Cycteine asparticacid-specific protease)；二、与细胞凋亡进程密切相关的线粒体；三、若干重要的细胞凋亡调控基因。前两者都属于信号转导的范畴。

2. 细胞凋亡的基本机制

复细胞生物（metazoan）在凋亡过程中拥有相似的酶反应机制。美丽线虫（Caenorhabditis Elegans）长久以来一直作为研究细胞凋亡机制核心组分的一个良好的模型。研究发现了三个重要的基因：促进凋亡的CED-3、CED-4和抑制细胞凋亡的CED-9。CED-3是一个蛋白酶，激活的CED-3 可以水解靶蛋白从而使细胞死亡；CED-4与CED-3结合并促进CED-3激活，CED-9则与CED-4结合并阻止它激活CED-3。正常情况下，CED-9与CED-4和CED-3结合，因此CED-3不处于激活状态。细胞凋亡信号会引起CED-9在上述复合体上解离下来，激活CED-3并最终发生凋亡。

脊椎动物则进化了一整套的基因家族：1. 哺乳动物Caspases与CED-3同源；2. Apaf-1基因与CED-4同源；3. 哺乳动物Bcl-2基因家族与CED-9在结构和功能上相似，但分为促进和抑制亚群。

3. 细胞凋亡的信号转导途径

细胞内外的许多信号刺激可以诱导细胞发生凋亡，如相应配体结合死亡受体如Fas、TNFR等、紫外线照射和电离辐射、抗癌药物、生长因子缺乏、过度表达某些特定的癌基因和抑癌基因等。尽管这些信号以及随后的反应途径多种多样，但现已公认，细胞凋亡后期的共同途径是Caspases的激活。

Caspases在细胞凋亡中的作用：Caspases与CED-3在序列和结构上同源，它们是在特异的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一类进化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族。功能上，激活的Caspases可以水解包括细胞调节、细胞信号转导、DNA修复、组织平衡、细胞存活等环节中重要的蛋白，从而使细胞表现为凋亡特有的形态学及生化特征：细胞皱缩、断裂，染色质聚集，DNA降解，以及随后的凋亡细胞被吞噬细胞迅速地清除等。

最先发现的Caspases就是ICE(Inteleukin-1β-converting enzyme)，现也称为Caspase-1。目前发现的Caspases包括Caspase 1 - 13，它们可分别在炎症和细胞凋亡中起到不同的作用。在细胞凋亡中起作用的又可分为两类：启始Caspases(Initiator，又称Upstream、 Apical caspases)和效应Caspases(Effector，又称Downstream caspases、Executioner)。启始Caspases包括8,9,10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的自杀过程；效应Caspases包括3，6，7等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。

Caspases在氨基酸序列、结构和底物特异性上具有相同的特征。Caspases酶原包含三个结构域：NH2末端结构域（Prodomain）、约20KD的大亚基和约10KD的小亚基。酶原的激活需要在大小亚基和N末端结构域内进行切割，然后大小亚基形成异源二聚体，并进而形成具有两个独立活性位点的四聚体，这就是被激活的酶。完成这个切割任务的可以是Caspases，也可以是其它的蛋白酶如Granzyme B。Caspase 3，6，7 N末端结构域较短，缺乏蛋白相互作用的功能区，因而最可能是通过其它蛋白酶切割的方式而激活。而更重要的激活方式是Caspases之间的相互作用称为Caspases Cascade。如Caspases 8的激活途径之一是这样的：死亡受体Fas或TNFR被配体（CD95L或TNF）结合后，可以通过一种叫FADD（Fas-associated death domain）的接头蛋白（adaptor）使Procaspase 8 聚集，这种聚集是通过DED结构域（死亡效应结构域，Death effector domain）的疏水作用来实现的，在Procaspase 8和FADD中均含有这种结构域。Procaspase 8本身具有成熟的Caspase 8酶的1-2%的活性，聚集后的Procaspase 8已经足够通过自身或相互之间的切割产生成熟的Caspase 8。激活的Caspase 8 又可激活下游的效应Caspase，并最终使细胞凋亡。与之相似， Procaspase 2可以由接头蛋白RAIDD介导通过CARD结构域（Caspase activation and recruitment domain）的相互作用聚集并激活。而对于Caspase 9来说， 它激活的途径与Caspase 8不太相同。细胞在应激或受到细胞毒、化疗药物作用时，会导致线粒体的破坏和释放出cyto-c（细胞色素c）（详见下文），在cyto-c、dATP和含CARD结构域的辅助分子Apaf-1（CED-4的同源分子）的协同作用下，Procaspase 9会通过CARD结构域之间的相互作用聚集并导致自我激活。Caspase 8 和Caspase 9的激活也代表了Caspases 激活的两种典型方式。

激活的Caspases最后导致细胞凋亡,虽然仍有许多不清楚的地方，但在其已经查明的约40个底物中，有一些已经证实其水解和最后的细胞凋亡直接相关。如ICAD/DFF45是CAD核酸酶（Caspases-activated deoxyribonuclease）的抑制蛋白，CAD核酸酶可以造成凋亡时DNA的片段化，在正常细胞中CAD与ICAD形成复合物因而不处于激活状态。细胞凋亡时，Caspases水解ICAD，CAD就会处于活性状态并最终使DNA片段化。另一个例子是Caspases在细胞凋亡时可以水解BCL-2蛋白，它不仅消除了BCL-2蛋白的抗细胞凋亡作用，而且研究显示BCL-2水解片段也有促细胞凋亡的作用，这实际上是一个正反馈的过程。Caspases还可以影响DNA修复、mRNA剪接、DNA复制等重要过程中的蛋白。因此，可以说Caspases蛋白酶在细胞凋亡过程中的作用处于中心地位。

线粒体在细胞凋亡中的重要性： 如前所述，在诸如细胞毒药物诱导细胞凋亡的信号转导途径中，线粒体在促凋亡信号和Caspases激活之间起着不可替代的作用。实际上， 线粒体在细胞凋亡中的作用远不止此。线粒体在细胞凋亡中的作用包括：释放Caspases激活因子如Cyto-c；丧失电子转移功能并减少能量的产生；线粒体跨膜电位的消失以及与BCL-2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相关等方面。甚至有人提出：线粒体在细胞凋亡中起着决定性的作用。实验证明，γ辐射、Ceramide（凋亡信号转导中的重要分子，介于促凋亡信号和凋亡过程之间）、Fas与配体结合等均可导致线粒体在电子转移方面功能的紊乱，从而影响呼吸链，ATP产量下降。这种能量代谢上的障碍主要发生在细胞凋亡的晚期。

线粒体在细胞凋亡过程中最重要的一点在于它可释放能够激活Caspases的蛋白。在无细胞的体系中，自发的、可以由Bcl-2抑制的染色质聚集和DNA片段化依赖于线粒体的存在，进而发现实际上是依赖于Cyto-c从线粒体中的释放。从线粒体释放的Cyto-c与Apaf-1、Procaspase 9结合在一起形成“凋亡体”（Apoptosome），其结果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外，线粒体还可释放其它介导细胞凋亡的分子：Procaspase 3和AIF（Apoptosis-inducing factor）。AIF在体外可作用于Procaspase 3，并且其本身可能就是一个Caspase。

线粒体发生上述改变的机制在于线粒体膜上一种叫PT通道（Permeability transiton pore，又叫Megachennal）的形成。促凋亡信号会使Caspases激活（某些Caspase的底物就是位于线粒体膜上的蛋白）、胞浆Ca++水平升高、产生Ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发PT通道。PT通道是由线粒体一些内膜外膜蛋白组成的，定位于内外膜接触点,并可以无选择性地允许≤1.5kD分子通过。这个通道的开放会由于线粒体基质内的高渗透压，使线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶连，能量产生中断；还会由于水和溶质的进入使基质肿胀并导致外膜破裂，释放出包括Cyto-c在内的各种活性蛋白。

线粒体在细胞凋亡中的重要性还在于它与Bcl-2基因家族之间的关系。实际上，很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于线粒体膜上。而且实验证实，BCL-2家族蛋白可以影响PT通道开放及其Cyto-c、AIF的释放，还可以改变线粒体外膜的通透性。如BAX一方面可以直接促使线粒体膜内的大小约为12kD的Cyto-c在外膜未被破坏的情况下通过某种通道释放至胞浆；另一方面，又可以激发PT通道的开放。而BCL-2蛋白则起抑制作用。

线粒体及Cyto-c在细胞凋亡中的中心地位虽然在不同信号诱导的细胞凋亡中不一定具有普遍意义，但线粒体作为细胞内死亡信号的感受者和放大者在细胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。

4. 重要的凋亡调控基因

Bcl-2 基因家族：新发现的成员使Bcl-2基因家族越来越庞大，包括抑制细胞凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、A1/Bf1-1、Bcl-w、Nr13、Mcl-1; 促进细胞凋亡的Bax、Bik、Bak、Bad、Bid、Hrk、Bcl-xS等。而更引人注目的Bcl-2家族蛋白作用的生化机制中与Caspases和线粒体之间的密切关系。

在细胞凋亡信号转导中，不可能是简单的一连串事件的组合，参与其中调控的其它基因还有很多，如Ceramide、NF-κB等。

5. 展望

尽管在过去数年中对凋亡机制的研究进展非常迅速，但仍有很多问题需要更进一步的了解。这主要包括以下几点：凋亡精确的生化机制及其不同的信号转导途径的调控；新的凋亡调控相关基因的发现；相关疾病如肿瘤中凋亡分子机制的异常；这些机制在疾病治疗中的意义等等。因此，要想搞清凋亡的复杂而精致的调控网络看来尚需时日。